研究背景

基于BRCA1在DNA双链断裂（double strand break，DSB）修复和基因组稳定性维持中的关键作用，BRCA1缺陷肿瘤基因组记录了肿瘤形成过程中细胞遭遇的DNA损伤事件和BRCA1缺陷引起的异常修复，呈现了特征性的突变模式（Mutational signatures）的富集。这些突变模式包括成簇点突变、短片段碱基增删（InDel）、易位和微同源序列（Microhomology，MH）介导的11 Kb的串联倍增（Tandem duplication，TD）¹。这些特征性的突变模式可以用于预测同源重组缺陷、指导癌症药物PARP抑制剂临床用药。然而，BRCA1缺陷导致基因组中这些突变模式累积的机制并不十分清楚²。先前，利用复制偶联DSB的定点诱导系统及DSB修复分析方法，我们发现，BRCA1缺陷肿瘤突变模式的一个主要诱因是源于DNA单链断裂（Single strand break，SSB）的复制偶联单末端DSB的产生及修复异常，而不是传统认为的独立于DNA复制的双末端DSB³。但是，解析特征性的MH介导的TD形成机制受限于所用系统中邻近DNA重复序列的干扰，难以真正捕捉在没有邻近重复序列的基因组区域中的TD形成机制，而这种区域超过50%的全基因组。因此，BRCA1缺陷肿瘤中复制偶联DSB修复异常如何产生特征性TD依旧未知。

 论文概要

2025年7月30日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院、浙江大学转化医学研究院谢安勇课题组在Nucleic Acids Research杂志在线发表了题为“Late steps of allelic break-induced replication suppress tandem duplication associated with BRCA1 deficiency”的研究论文。研究团队创新性地创建了无重复序列的TD报告系统以及内源性位点特异性TD定点诱导和检测方法，发现BRCA1缺陷导致修复复制偶联DSB的最常用、最精准的HR亚途径“等位断裂诱导复制途径（Allelic break-induced replication, aBIR）”失灵，从而诱导特征性MH介导的TD的富集。具体地，在复制偶联DSB的aBIR修复过程中，由于BRCA1缺陷，复制偶联DSB末端在第一轮等位链入侵后过早终止DNA合成，解离的新生链更多利用MH进行非等位的第二轮链入侵，启动MH介导的BIR（MH-mediated BIR，MMBIR），从而提高MH介导TD的形成。这条途径因此称之为aBIR-MMBIR，是首次揭示的TD形成新途径。 

结果分析与阐述

为了能在无重复序列基因组区域定点分析TD的产生频率和机制，研究团队在小鼠胚胎干细胞中建立了一个TD报告系统，在这个报告系统上，利用Cas9缺刻酶（如Cas9^D，代表Cas9 D10A；Cas9^H，代表Cas9 H840A）定点诱导复制偶联DSB。这种DSB可能利用如下两种机制形成MH介导的TD产物，产生RFP⁺细胞：MMBIR和aBIR-MMBIR（图1）。同时也在内源位点建立了不依赖于报告系统的TD定点产生和分析方法，并连同TD报告系统，进行了测试和验证。通过比较BRCA1正常细胞和缺陷细胞的复制偶联DSB诱导的TD形成，研究团队发现，BRCA1缺陷显著提升TD发生频率（图1），该现象与经典型非同源末端连接（c-NHEJ）无关。而且，TD产物结构的分析显示，MMBIR和aBIR-MMBIR的确是复制偶联DSB诱导产生TD的两个主要机制。

图1.BRCA1缺陷提升复制偶联DSB诱导的TD发生频率。A：复制偶联DSB诱导的TD形成的两种可能机制； B：在BRCA1正常和缺陷细胞中复制偶联DSB诱导的TD形成频率。

但是，BRCA1的RAD51加载功能缺失并不导致TD产物提升。无论是RAD51或BRCA2敲减，还是用于加载RAD51的BRCA1 coiled-coil结构域的缺失，都没有提升TD形成，反而降低。另一方面，在BRCA1的C-端结构区域缺失时，BRCA1功能受损，TD富集，但RAD51的敲减不改变这种BRCA1缺陷细胞的TD提升水平（图2）。这表明，BRCA1缺陷相关的TD形成机制部分依赖于RAD51，部分不依赖。

图2.复制偶联DSB诱导的TD形成需要BRCA1的RAD51加载功能。A：RAD51和BRCA2敲减降低复制偶联DSB诱导的TD形成；B: BRCA1的CC结构域缺失降低复制偶联DSB诱导的TD形成；C：BRCA1缺陷细胞中复制偶联DSB诱导的TD形成不受RAD51敲减的影响。

考虑到RAD51加载对同源序列搜寻和链侵入至关重要，RAD51依赖性提示，BRCA1的TD抑制机制也可能发生在链侵入之后。进一步的研究发现，RAD54缺失提高BRCA1缺陷相关的TD形成。因为RAD54促进同源序列搜寻和链侵入，这提示，RAD54抑制RAD51依赖的TD形成。此外，BARD1缺失也提高TD水平，而且是通过影响RAD51结合，因此，我们推测，BRCA1-BARD1复合体是通过结合RAD51稳定D-loop延伸，防止新生链提前脱离，进而抑制TD形成（图3）。这些结果均表明BRCA1可以通过调控aBIR后期步骤抑制TD形成。

图3.BRA1抑制复制偶联DSB诱导的TD形成部分通过BARD1-RAD51互作实现。

值得一提的是，在aBIR-MMBIR途径中，aBIR阶段的DNA合成可利用等位基因序列完美修复原始断裂点，使TD产物中DNA原始断裂点呈现"无疤痕"特征。而传统的全基因组分析通常不能识别这种隐藏的“无疤痕”断裂点⁴，可能误将微同源序列接口判为断裂点，据此推导出错误的机制来解释TD的形成，比如误认为是单纯的MMBIR机制，从而掩盖了本研究发现的真实的aBIR-MMBIR机制。

图4.BRCA1抑制复制偶联DSB诱导的TD形成的机制示意图。

研究总结

本研究通过建立无重复序列干扰的TD定点诱导和分析研究工具，真实模拟无临近重复序列基因组TD形成环境。在此基础上开展的研究不仅表明复制偶联DSB是诱导BRCA1缺陷相关TD形成的主要DNA损伤来源之一，而且首次揭示BRCA1通过调控复制偶联DSB修复的aBIR途径晚期步骤抑制TD形成以及RAD51在其中扮演的双面角色（图4）。这些研究发现不仅为理解BRCA1缺陷相关特征性TD的形成机制提供了新视角，提升领域内对BRCA1缺陷肿瘤基因组不稳定性的认识，也为新诊疗策略的开发提供了重要的理论基础。此外，Cas9缺刻酶Cas9^D和Cas9^H在BRCA1正常细胞中也诱导TD的高频产生，警示在基于Cas9缺刻酶的基因组编辑应用（比如碱基编辑和引导编辑）中产生异常染色体重排的潜在风险⁵。

原文链接DOI：https://doi.org/10.1093/nar/gkaf729。

 作者简介

浙江大学医学院附属邵逸夫医院/浙江大学转化医学研究院谢安勇为本文的通讯作者。黄志成博士为本文的第一作者。本研究受到科技部重大项目、国家自然科学基金和杭州市科技局项目经费支持。

 参考文献：

[1]       Menghi F, Barthel FP, Yadav V et al. The tandem duplicator phenotype is a prevalent genome-wide cancer configuration driven by distinct gene mutations. Cancer Cell 2018; 34:197–210.

[2]       Davies H, Glodzik D, Morganella S et al. HRDetect is a predictor of BRCA1 and BRCA2 deficiency based on mutational signatures. Nat Med 2017; 23:517–25.

[3]       Feng Y-L, Liu Q, Chen R-D et al. DNA nicks induce mutational signatures associated with BRCA1 deficiency. Nat Commun 2022; 13:4285

[4]       Lam HYK, Mu XJ, Stütz AM et al. Nucleotide-resolution analysis of structural variants using BreakSeq and a breakpoint library. Nat Biotechnol 2010; 28:47–55

[5]       Tao J, Bauer DE, Chiarle R.Assessing and advancing the safety of CRISPR–Cas tools: from DNA to RNA editing. Nat Commun 2023; 14:212